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　　1.1 熒光探針技術(shù)的優(yōu)點

　　熒光探針技術(shù)可有很多分類方法：例如，按照熒光探針物質(zhì)本身的性質(zhì)可以分為有機熒光探針，高分子熒光探針，量子點熒光探針等。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、方法簡便、快速準確、線性范圍寬等優(yōu)點^.因此，與一般的分析方法相比，熒光分析法在定量分析中具有明顯的優(yōu)勢。它通常分為兩大類，一是直接測定法；二是間接測定法。直接測定法是利用物質(zhì)本身發(fā)射的熒光來進行測定的分析方法。由于不少物質(zhì)本身不發(fā)熒光或者發(fā)射熒光較弱，不能進行直接的熒光測定，從而妨礙了直接測定法的應(yīng)用范圍。間接測定法是利用特定的方法將某些熒光較弱或本身不發(fā)熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)熒光的物質(zhì)再進行測定的方法，也可以稱為“熒光探針”技術(shù)。熒光探針的使用極大地擴大了熒光分析法的應(yīng)用領(lǐng)域。

　　1.2還原型谷胱甘肽

　　還原型谷胱甘肽存在生物體中，基本上分布在生物的所有器官，是含量最豐富的硫醇分子。GSH由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成的三肽分子，在正常情況下，GSH的水平異常直接會導(dǎo)致癌癥、心臟病、衰老、以及其他的疾病。在許多生命活動中，GSH起著直接或者間接的作用包括基因表達調(diào)控、酶活性、代謝調(diào)節(jié)、對細胞的保護、氨基酸轉(zhuǎn)運和免疫功能調(diào)節(jié)等。

　　1.3檢測還原型谷胱甘肽的探針

　　Shao^[1]等合成了一種專一測定GSH的雙螺吡喃探針，在水溶液中，該探針與谷胱甘肽反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)為K=(7.52±1.83)×10⁴ M^-1，該探針的優(yōu)點是，能專一測定GSH，并不受其他多肽類和氨基酸的干擾。因此，該探針可以用于檢測細胞內(nèi)GSH的含量。其檢測的主要原理是，在中性溶液中，該分子的識別功能是以螺吡喃開放的部花菁形式與分析物之間的靜電作用力及結(jié)構(gòu)互補性為基礎(chǔ)，在體系中加入GSH后，部花菁形式打開，反應(yīng)體系的熒光強度發(fā)生改變，在發(fā)射波長500 nm處，隨著谷胱甘肽濃度增加，熒光強度不斷降低，相反，在發(fā)射波長643 nm處，熒光強度不斷升高。該探針已經(jīng)成功用于在人T細胞中GSH的熒光成像分析。

　　Li^[2]等在金納米粒子的基礎(chǔ)上合成一種專一檢測GSH的比色探針。在空白溶液中，加入雙二硫代甲基甲酸哌嗪鈉，形成金納米聚合物，反應(yīng)體系顏色由紅色變?yōu)樗{色，從立體結(jié)構(gòu)上分析，GSH含有多個突出的基團(–SH, –NH₂ 和 –COOH)，相對于雙二硫代甲基甲酸哌嗪鈉而言，GSH與金納米粒子之間吸引力更強，可以在反應(yīng)中作為一種抗聚合試劑。所以，金納米聚合物與GSH反應(yīng)以后，金納米粒子聚合物進而“解體”呈現(xiàn)分散狀態(tài)，體系顏色由藍色變?yōu)樽仙�最后變成酒紅色，而其他氨基酸不干擾其測定。

　　Ma^[3]等以Fe₃O₄納米粒子為基礎(chǔ)，利用比色法專一檢測GSH。該報道中介紹，F(xiàn)e₃O₄作為一種過氧化酶的模擬物，在反應(yīng)中起到催化作用。首先，通過加入催化底物2,2-偶氮-雙(3-苯并-二氫噻唑-6-磺酸)(ATBS)二胺鹽和雙氧水通過共沉淀方法制備Fe₃O₄納米粒子，在實驗體系中，加入GSH，消耗雙氧水，引起整個體系顏色發(fā)生改變，裸眼可以觀察到此實驗現(xiàn)象。此方法檢測GSH的線性范圍為3.0-30.0 μΜ�；厥章蕿�96.7-107%，其他硫醇類氨基酸并不干擾其測定，該方法已經(jīng)成功用于A549細胞中GSH的檢測。

　　Niu^[4]等合成了一種以氟化硼絡(luò)合二吡咯(BODIPY為母體的比率型熒光探針，該探針與硫醇類物質(zhì)發(fā)生親核取代反應(yīng)，導(dǎo)致體系熒光波長紅移，Cys或者Hcy側(cè)鏈上的氨基能進一步取代硫醇的S原子，而形成氨基取代的BODIPY，熒光波長藍移。然而，GSH只能發(fā)生親核取代，不能進一步取代硫醇的S原子，體系熒光波長不會藍移。所以，很容易將GSH從Cys或者Hcy中區(qū)分出來。在溫度為37℃，乙腈/緩沖液(5:95v/v)的條件下，探針和GSH反應(yīng)的熒光比率為I₅₈₈/I₅₅₆，在588 nm處，隨著GSH濃度的增加，體系的熒光強度不斷增強，相反在556 nm處，熒光強度不斷降低。在加入其它氨基酸包括與其結(jié)構(gòu)相似的Cys和Hcy后，都不干擾探針與GSH的反應(yīng)。)

　　以上是檢測GSH的熒光技術(shù)的幾種研究成果，目前多數(shù)科研工作者參考此類方法進行GSH的檢測。

　　參考文獻

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　　[3]Ma Y. H., Zhang Z. Y., Ren C. L., et al. A novel colorimetric determination of reduced glutathione in A549 cells based on Fe₃O₄ magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics[J]. Analyst, 2012, 137: 485-489

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化工教研組：董維華